LABORATÓRIO DE PHAGE DISPLAY

PESQUISADORES PRINCIPAIS:

  • Rodrigo Guerino Stabeli - Biólogo, Doutorado em Bioquímica pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Diretor Científico IPEPATRO
  • Carla Freire Celedonio Fernandes - Doutorado em Ciências Naturais pela Philipps-Universitaet Marburg, Alemanha, Farmacêutica - Funcionária Pública vinculada ao Centro de Pesquisa em Medicina Tropical - CEPEM/IPEPATRO

EQUIPE

  • Soraya dos Santos Pereira - Doutoranda/PGBIOEXP/ UNIR
  • Guilherme Silverio de Oliveira - Doutorando/PGBIOEXP/UNIR
  • Gabrielle Veiga de Lima Correa - Iniciação Científica/ PIBIC/CNPq/UNIR
  • Suzanna Ribeiro Hassen - Iniciação Científica/ PIBIC/CNPq/IPEPATRO

COLABORAÇÕES

COLABORADORES REGIONAIS:

  • Marivaldo Rodrigues Figueiró, Médico Veterinário/ EMBRAPA-RO
  • Cléberson de Freitas Fernandes, Pesquisador/ EMBRAPA-RO
  • Leonardo de Azevedo Calderon, Biólogo/ CEBIO/UNIR

COLABORADORES NACIONAIS

  • Gerhard Wunderlich/ICB-USP

PROJETOS DE PESQUISA EM ANDAMENTO

  • Produção, purificação, caracterização físico-química e funcional de anticorpos tipos cadeias simples (VHH) contra epítopos dos vírus de febre amarela e raiva produzidos em Lama glama utilizando a técnica de phage display. Palavras- chave: Anticorpos do tipo VHH, febre amarela, raiva, phage display, Llama glama

 

Camelídeos produzem, além de anticorpos convencionais contendo cadeias leves (VL) e pesadas (VH), imunoglobulinas G funcionais, contendo somente cadeias pesadas (VHH). A região VHH, nessas proteínas, é responsável pelo reconhecimento e neutralização do antígeno e possui algumas vantagens quando comparadas aos anticorpos convencionais. Entre elas, seu tamanho reduzido, boa capacidade de renovelamento, maior estabilidade a alterações de temperatura e alta capacidade de penetração em tecidos densos. Devido às características apresentadas pelos anticorpos tipo VHHs, nosso laboratório vem padronizando técnicas objetivando produzir anticorpos monoclonais do tipo VHH de Llama glama contra epítopos relevantes do vírus da febre amarela e raiva a partir da cepa vacinal YF-17DD e vacina anti-rábica inativado cepa WISTAR PM/WI 38-1503-3M, utilizando a técnica de Phage Display. Inicialmente foram padronizadas as técnicas de imunização dos camelídeos, bem como os testes imunoenzimáticos (ELISAs) para acompanhamento da resposta imune dos animais. Paralelamente, foram purificadas as frações de imunoglobulinas IgG1, IgG2 e IgG3 através de cromatografias de afinidade. De acordo com os resultados dos ELISAs, linfócitos periféricos foram isolados do sangue do animal e então realizada extração de RNA total, síntese de cDNA, amplificação das cadeias pesadas das imunoglobulinas através de RT-PCR, digestões enzimáticas do inserto e do vetor para a preparação do DNA recombinante, ligação e posterior transformação em E.coli TG1 por eletroporação. Cerca de dez clones foram seqüenciados e todos apresentaram o fragmento VHH inserido. Atualmente, estamos buscando alternativas para melhorar a eficiência das transformações e seguirmos ao passo de seleção clonal. Financiamento: GENOPROT FINEP 2007.Vigência: 2009-2012.

PUBLICAÇÕES

APRESENTAÇÃO DE RESUMOS EM CONGRESSOS NACIONAIS:

  • CORREA, G. V. L. ; HERRMANN, B.Y. ; PEREIRA, S. S. ; STÁBELI, R.G. Produção de anticorpos antiamarílicos em Llama glama utilizando a técnica de Phage Display. 2009. XXI Salão de Iniciação Científica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS.

ORIENTAÇÕES EM ANDAMENTO

ORIENTAÇÕES DE DOUTORADO

  • Soraya dos Santos Pereira - Produção, purificação, caracterização físico-química e funcional de anticorpos tipos cadeias simples (VHH) contra epítopos dos vírus de febre amarela produzidos em Lama glama utilizando a técnica de phage display - PPGBIOEXP - Universidade Federal de Rondônia - UNIR
  • Guilherme Silvério Oliveira - Produção, purificação, caracterização físico-química e funcional de anticorpos tipos cadeias simples (VHH) contra epítopos dos vírus da raiva produzidos em Lama glama utilizando a técnica de phage display - PPGBIOEXP - Universidade Federal de Rondônia - UNIR

 

ORIENTAÇÕES DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA

  • Gabrielle Veiga de Lima Correa - Produção de Anticorpos antiamarílicos em Llama glama utilizando a técnica de Phage Display -
  • Suzanna Ribeiro Hassen - Purificação da Fração IgG e Produção de Anticorpos Policlonais Específicos Contra Imunoglobulinas G de Cadeia Pesada de Lama glama em Coelhos

BALANÇO ANO DE 2009

No primeiro semestre de 2009, foram mantidas atividades iniciadas em 2008 na tentativa de clonar e expressar os VHH, uma vez que o camelídeo já havia sido imunizado com antígenos da vacina da febre amarela e veneno de serpente B.jararacussu, foram realizadas amplificação das cadeias pesadas das imunoglobulinas através da técnica de RT-PCR com dois primers gene-específicos do material que havia sido isolado e extraído (Isolamento/RT-PCRI) que encontrava-se armazenado -20ºC. Houve inúmeras tentativas para preparação de biblioteca primária utilizando ligações de DNA recombinante com concentrações e condições diferentes, na busca da padronização das técnicas, não obtivemos êxito em relação à competência esperada das bactérias. Também foram realizadas extrações de RNA a partir de material armazenado no freezer -80 ºC em Trizol®, foram preparados novos cDNA e amplificados através da técnica de RT-PCR, seguidos de preparação do DNA recombinante, e posterior transformação por eletroporação como uso de células eletrocompetentes, havendo novamente resultados semelhantes aos anteriores, no entanto deu-se continuidade aos procedimentos de clonagem alcançando uma competência de 104 células, fizemos a técnica de panning para seleção dos anticorpos, no entanto não obtivemos êxito nos experimentos até então realizados não havendo seleção especifica dos anticorpos de interesse.

No segundo semestre de 2009, foi integrada a equipe para suporte técnico/científico direto aos experimentos, a farmacêutica Drª. Carla Freire Celedonio Fernandes. Foram realizados experimentos utilizando amostras que estavam a – 20oC, remanescentes de 2008 e primeiro semestre de 2009. A maioria das amostras de ligação armazenadas não foi visualizada em gel controle e então descartada. Algumas amostras foram transformadas em células eletrocompetentes, porém foi verificado contaminação da cepa com bactérias resistentes ao antibiótico de seleção. Assim, novas cepas do laboratório stratagene foram adquiridas e células eletrocompetentes home made. Em seguida, foram realizadas diversas transformações, alguns clones foram seqüenciados e os clones isolados armazenados a -80oC (cerca de 104). Como os resultados obtidos não foram suficiente para a montagem da biblioteca de fagos, novos camelídeos foram adquiridos para reiniciar os procedimentos de imunização com antígenos antiamarílicos e da raiva, como também padronizar as técnicas empregadas.

Em relação ao ano anterior houve a aquisição de novos animais, possibilitando estabelecer imunizações com antígenos de interesse; Padronização de metodologias para imunização dos animais, de testes imunoenzimáticos-ELISA, além de padronização de técnicas moleculares e preparação de células eletrocompetentes; Estruturação do ambiente laboratorial com aquisição de bancadas e equipamentos novos para o desenvolvimento de técnicas experimentais. Além de deixar o ambiente mais organizado, este ponto tornou o local mais cômodo para realização das atividades científicas.

 

PLANO DE TRABALHO PARA 2010

  • Apresentação em Congressos

A partir dos resultados até então obtidos, será possível submeter alguns resumos em congressos de relacionados aos itens abaixo:

1. Produção de anticorpos anti-llama IgG2/IgG3 em coelhos e suas aplicações.

2. Confecção de biblioteca de VHH para produção de anticorpos monoclonais contra febre amarela.

3. Confecção de biblioteca de VHH para produção de anticorpos monoclonais contra raiva.

4. Atividade neutralizante in vitro dos anticorpos monoclonais selecionados.

5. Caracterização funcional dos anticorpos monoclonais selecionados.

6. Caracterização funcional de proteínas de membrana através de estudos de interações moleculares com produtos da biodiversidade amazônica.

  • Publicações em Revistas Indexadas

Pelo menos dois artigos relacionados à produção e caracterização de anticorpos monoclonais contra raiva e febre amarela.

  • Submissão de projetos de pesquisa a agências financiadoras.

1. Participação no EDITAL Nº 002/2010/SEPLAN/ CNPq - Programa de INFRA-ESTRUTURA PARA JOVENS PESQUISADORES PROGRAMA PRIMEIROS PROJETOS – PPP com o projeto intitulado: Ampliação do Laboratório de Pesquisa para Produção de Imunobiológicos Voltados a Doenças de Relevância Humana do Complexo IPEPATRO-CEPEM-FIOCRUZ, VALOR PLEITEADO: R$ 30.000,00.

2. Participação no EDITAL Edital MCT/CNPq Nº 014/2010 – Universal, projeto intitulado: Estudo de Interações Moleculares entre Proteínas Carreadoras de Medicamentos e Substratos Endógenos & Produtos da Biodiversidade Amazônica, VALOR A SER PLEITEADO: R$ 20.000,00.

3. Solicitação de recurso ao DAAD (Serviço Alemão de Intercâmbio Acadêmico) até € 20.000 para materiais de consumo e equipamentos. Programa para recém-doutores ex-bolsistas DAAD, objetiva desenvolver projetos em cooperação com Universidades Alemãs; FLUXO CONTÍNUO.

  • Produtividade de conhecimento e extensão

A partir da padronização das técnicas envolvidas na produção de anticorpos monoclonais propostos para tratamento e/ou diagnóstico de raiva e febre amarela, pretende-se, paralelo a caracterização in vitro e in vivo desses anticorpos, expandir a técnica para produção de VHHs contra outros vírus, toxinas bacterianas ou ainda de animais peçonhentos.

Proteínas de membrana, responsáveis pelo transporte de íons, substratos orgânicos e drogas hidrossolúveis, são hoje alvos importantes da indústria farmacêutica para produção de novos fármacos. Visto que imersos numa região de grande biodiversidade podemos extrair da natureza informações interessantes na busca de terapias para diversas patologias, estamos trabalhando na perspectiva de implantação de uma nova linha de pesquisa voltada a caracterização molecular e funcional de proteínas de membrana de importância em saúde.