PLATAFORMA TÉCNICA

PESQUISADOR PRINCIPAL

  • Eduardo Resende Honda - Doutor em Biotecnologia pela Universidade Federal do Amazonas (UFAM), Diretor do Centro de Pesquisa em Medicina Tropical do Estado de Rondônia (CEPEM), Assessor Técnico do IPEPATRO, Docente Colaborador/PGBIOEXP/Universidade Federal de Rondônia - UNIR.

 

EQUIPE

  • Deusilene Souza Vieira - Bióloga, Doutora/PGBIOEXP/UNIR, Pesquisadora/IPEPATRO.
  • Quéssia Débora Mamani Ferreira - Bióloga, Mestre/PGBIOEXP/UNIR, técnica em Nível Superior - Bolsista DTI/CNPq/IPEPATRO.
  • Rudson Holanda de Jesus - Biólogo, Doutorando/PGBIOEXP/UNIR, bolsista CNPq/IPEPATRO / UNIR.
  • Alcione Oliveira de Santos - Bióloga, Mestranda/PGBIOEXP/ UNIR, bolsista CNPq/ IPEPATRO/ UNIR.
  • Carina Godoy Picelli - estudante de Farmácia, estagiária IC/IPEPATRO
  • Fabileudes Gomes Ribeiro - Biomédico, Técnico de Nível Superior da Secretária do Estado de Saúde/CEPEM/ SESAU

COLABORAÇÕES

COLABORADORES NACIONAIS

· Sérgio Oliveira de Paula - Doutor, Docente/UFV/Minas Gerais.

· Glaucia Paranhos Baccala - PhD, Diretora de Pesquisa da Fundação Mérieux em Lyon-França

COLABORADORES REGIONAIS

· Juan Miguel V. Salcedo - Doutor, Diretor de Serviço de Saúde do CEPEM/IPEPATRO, Docente/UNIR

 

PROJETOS DE PESQUISA EM ANDAMENTO

  • Identificação, quantificação e genotipagem do vírus da hepatite C em amostras de soro de pacientes da região Amazônica por PCR em tempo real

 

O vírus da hepatite C (HCV) pertence à Família Flaviviridae. Apresenta uma única fita de RNA com cerca de 9600 nucleotídeos. A detecção direta do RNA viral tornou-se uma ferramenta essencial no diagnóstico da infecção; suas vantagens incluem a possibilidade de detecção precoce na infecção viral aguda. A metodologia de PCR em tempo real permite a detecção do produto à medida em que vai sendo formado, permitindo a resolução de uma ampla faixa de carga viral, mostrando ser uma alternativa para a detecção e quantificação do RNA do HCV. Objetivo geral: Desenvolver um diagnóstico qualitativo e quantitativo em amostras de soro de HCV de pacientes da região Amazônica por PCR em tempo real. Materiais e Métodos: Foram analisadas 40 amostras de soro de pacientes com suspeita clínica da doença com marcadores sorológicos positivos atendidos no Ambulatório de Hepatite do CEPEM. A obtenção do RNA foi feita através do kit QIAamp® viral RNA e para transcrição foi utilizado o kit TaqMan Reverse Transcription. A PCR em tempo real foi feita utilizando 6µl de cDNA. A quantificação foi feita através de uma curva padrão externa que consiste em alíquotas de concentrações conhecidas. Resultados: A detecção do HCV foi realizada com a técnica de PCR em tempo real e para a produção da curva padrão foi selecionadas 2 amostras com carga viral conhecida utilizada como controle na reação. A PCR convencional foi utilizada para amplificar essas amostras, os fragmentos amplificados foram seccionados do gel de agarose e purificados para ligação em vetor de clonagem. Para a transformação utilizou-se cepas de E.coli, seguido de miniprep e linearização do plasmídio. Para produção do transcrito foi utilizando kit Ribomax. Em seguida realizou-se a quantificação do transcrito e diluição seriada para a quantificação das 38 amostras. Conclusão: Pela metodologia de PCR em tempo real as amostras analisadas foram identificadas e quantificadas em uma única reação permitindo uma maior sensibilidade em pacientes com baixas cargas virais. Apoio: SESAU/IPEPATRO/ SUS/ CNPq/CEPEM

 

  • Amplificação, clonagem e expressão de peptídeos truncados das proteínas de envolope (e) e não estrutural (ns1) do vírus dengue.

 

O vírus dengue (DENV) é classificado de acordo com suas características antigênicas em quatro sorotipos: DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. O genoma do DENV tem aproximadamente 11kb, com três proteínas estruturais e sete não estruturais. A proteína estrutural do envelope (E) é uma glicoproteína, constitui o principal componente do envelope viral e representa o mais importante alvo do sistema imune. A proteína não estrutural 1 (NS1) é uma glicoproteína, possui atividade na maturação viral, sendo responsável pela fixação do complemento é encontrada na superfície ligada a membrana da célula infectada sendo também secretada no plasma de indivíduos infectados. Objetivos: Analisar por bioinformática as seqüências de aminoácidos das proteínas de Envelope e Não Estrutural NS1 para determinar peptídeos dessas duas proteínas e desenhar primers para amplificação e após trunca-lós para serem utilizadas como antígeno recombinante no diagnóstico da dengue. Material e métodos: As seqüências foram amplificadas por RT-PCR, os fragmentos correspondentes ao gene E e NS1 ligados ao vetor de clonagem e subclonados em vetor de expressão procariótico. Estes clones foram seqüenciados e alinhados por bioinformática para analisar a especificidade da seqüência produzida. Resultados: O fragmento foi obtido através de RT-PCR, resultando um produto de 160pb. O seqüenciamento foi realizado através do Termo Sequenase Kit e o analise das seqüências foi feita pelo programa BLAST demonstrando que a truncagem das duas proteínas teve alinhamento de 100% com o vírus do dengue. Em resultados preliminares estas proteínas estão sendo expressas para ser usada em testes imunoenzimáticos. Conclusão: A proteína E e NS1 tem um grande potencial antigênico e imunogênico, podendo vir a ser usada como antígeno alternativo com a vantagem da precocidade dada pela proteína NS1 e regiões antigênicas conhecidas da proteína E. Apoio: IPEPATRO/ SUS/ CNPq/CEPEM

 

  • Expressão do antígeno Delta recombinante para produção de insumos diagnósticos

 

O vírus da hepatite delta (VHD) é um vírus pequeno, defectivo que necessita do VHB para sua expressão. É composto de um envoltório de HBsAg, de uma porção interna de RNA e de uma proteína chamada delta. A infecção pelo VHD pode ser simultânea à infecção pelo VHB, caracterizando a co-infecção, ou pode ser posterior, causando a superinfecção. Pela sua associação obrigatória com a hepatite B, largamente disseminada em extensas regiões do território brasileiro - particularmente na Região Amazônica - e pelo grande potencial de gravidade clínica, esse novo tipo de hepatite reveste-se de grande importância no quadro sanitário, nacional. Objetivos: O presente estudo tem por finalidade expressar o antígeno delta através de técnicas de biologia molecular para produção de insumos diagnósticos. Material e Métodos: Inicialmente foram desenhados oligonucleotídeos para amplificação do produto de PCR baseado em seqüências armazenadas no Genbank. O RNA extraído a partir de amostra de paciente foi transcrito pela reação da transcriptase reversa, e o cDNa foi amplificado pela PCR. O DNA foi clonado no vetor pTZ57R (Fermentas) e subclonado no vetor de expressão PRSET-A (Invitrogen-USA). A proteína contendo a cauda de histidina foi purificada pelo método de cromatografia Líquida de Alta eficiência (HPLC). Foram feitos ensaios imunoenzimáticos para verificar a reatividade dos anticorpos dos pacientes infectados contra a proteína recombinante. Resultados: Nossos resultados preliminares mostram na reação de PCR a amplificação de um fragmento de 515pb. O produto da expressão resultou uma banda majoritária de 25 kDa. Conclusões e Perspectivas: A obtenção do antígeno delta na forma recombinante permite a produção de insumos reagentes visando verificar a especificidade dos anticorpos dos pacientes infectados pela hepatite delta. Os soros de pacientes infectados por hepatite delta foram testados quanto à presença de imunoglobulinas anti-Delta. Atualmente esta sendo desenvolvida a padronização do ensaio consistira em adsorver na placa de Elisa (96 poços) proteínas recombinantes produzidas em nosso laboratório. Apoio: SESAU/IPEPATRO/ SUS/ CNPq/CEPEM

 

  • Análise molecular do vírus da hepatite Delta por PCR em tempo real e PCR convencional

 

O diagnóstico laboratorial para infecção delta é complexo, em decorrência do tipo de infecções e dos diferentes marcadores sorológicos tanto para o VHB quanto para o VHD para antígenos virais ou anticorpos específicos. O fato de não haver um método quantitativo convencional padronizado e a ausência de testes comerciais para estes fins dificulta a monitoração e eficácia do tratamento em casos de infecções crônicas e a detecção do HDAg em pacientes com baixa carga viral (Le Gal et al., 2005). A infecção pelo HDV na região norte motiva o desenvolvimento de testes que reúna características qualitativas e quantitativas numa única reação, como o “Real Time - PCR”, podendo representar um avanço no diagnóstico laboratorial tornando útil na avaliação da resposta ao tratamento da hepatite delta crônica. Objetivos: Neste trabalho propomos identificar, o Vírus da hepatite D pela técnica de PCR convencional e quantificar e determinar os genótipos do vírus Delta pela técnica de PCR em tempo real baseado no sistema TaqMan®. Material e Métodos: O RNA extraído a partir de amostra de paciente foi transcrito pela reação da transcriptase reversa, e o cDNA foi amplificado pela PCR em tempo real e convencional. Resultados e Perspectivas: Foi possível padronizar os testes moleculares através do PCR convencional e em tempo real. Concomitantemente foi feita à construção de uma curva padrão externa e com um controle interno de cada reação possibilitando o controle de todas as fases na metodologia do PCR em tempo real. A fase subseqüente é referente a testes com amostras de pacientes para o processo de quantificação viral. Apoio: SESAU/ IPEPATRO/ SUS/ CNPq/CEPEM

 

  • Identificação e quantificação de DNA do vírus da hepatite B por PCR em tempo real em amostras de pacientes da região amazônica. Palavras-chave: hepatite b;PCR em tempo real;quantificação

 

O Brasil é classificado pela Organização Mundial da Saúde como um país de elevada prevalência para hepatite B, particularmente na Amazônia Legal. Estima-se que dos 15% da população que já se contaminaram com o vírus, 8% concentram-se na região Amazônica. Nos últimos anos a metodologia de PCR em tempo real vem se mostrando com uma alternativa mais útil, quando comparada a métodos baseados na presença de HBeAg, onde devido a alta variação genética do vírus que continua a se replicar, porém sem secretores de HBeAg. A quantificação dos níveis de DNA do vírus da hepatite B é importante para determinar o nível de replicação viral, para avaliar a resposta a tratamento com antivirais e acompanhar a resistência a esses medicamentos. Objetivos - O presente estudo visa identificar e quantificar o vírus da hepatite B em amostras de pacientes por PCR em tempo real. Material e métodos - Foram analisadas 20 amostras de pacientes com carga viral determinada. A extração do DNA viral foi realizada através do QIAamp® DNA Mini Kit, conforme instruções do fabricante. Em seguida as amostras foram submetidas à reação de PCR em tempo real, com a presença de controles positivos e negativos. Resultados Preliminares - Das 20 amostras de DNA extraídas e submetidas à PCR em tempo real, 18 amostras amplificaram. Conclusão - A tecnologia de PCR em tempo real tem potencial de aplicação como um teste sensível, suficiente para diagnostico e confirmação prognostica da eliminação do vírus nos casos de tratamento bem sucedido e também como teste quantitativo capaz de monitorar a queda na carga viral de pacientes durante o tratamento. Em relação a curva de dissociação utilizada no sistema SYBER Green, torna-se necessário outros testes para melhorar a especificidade do diagnóstico do vírus da hepatite B, como também a quantificação das amostras utilizando um controle padrão. Apoio: SESAU/ IPEPATRO/ SUS/ CNPq/CEPEM

 

  • Mapeamento de mutações do vírus da hepatite B de pacientes em acompanhamento no ambulatório de hepatites do Cepem/Rondônia

 

O vírus da hepatite B (HBV) em seu mecanismo de replicação transcriptase reversa pode induzir mutações que tem sido constantemente observada na prática clínica. Dentre as formas mutantes, a mais freqüente corresponde ao impedimento da síntese da proteína HBe na região Pré-Core do genoma. Este tipo de mutação dificulta o diagnóstico sorológico, uma vez que a presença do anticorpo anti-HBe corresponde a um perfil de não replicação. Esta mutação relaciona-se com aumento na patogenicidade do vírus, assim como prolonga o tempo de tratamento e diminui a resposta virológica. O Estado de Rondônia, localizado na Amazônia Ocidental, apresenta-se como região de alta endemicidade para o HBV, no entanto poucos estudos têm sido realizados, principalmente por procedimentos moleculares, impossibilitando acompanhar de forma mais ampla o curso da doença nestes pacientes. No ambulatório do CEPEM aproximadamente 40 pacientes são caracterizados laboratorialmente como mutantes. Objetivos - Analisar por bioinformática o seqüenciamento das amostras e identificar as mutações existentes. Materiais e Métodos - Através do PCR convencional foram amplificadas as regiões Pré-Core/Core em 12 amostras com objetivo de padronizar o diagnóstico qualitativo molecular para HBV. Resultados - Estas amostras positivas foram enviadas para sequenciamento das regiões de interesse para estudos posteriores e análises das mutações, genotipagem e aplicações em PCR Real-Time. Conclusão - A perspectiva deste estudo é ampliar a detecção de mutações em outras regiões do genoma viral, como também traçar o perfil genotípico dos pacientes deste ambulatório, e ainda a quantificação da carga viral por PCR - Real Time e ampliação destes diagnósticos para outros Estados da Região Norte que também não possuem essas práticas como rotina. Apoio: SESAU/ IPEPATRO/SUS/CEPEM

PUBLICAÇÔES

APRESENTAÇÕES DE RESUMOS EM CONGRESSO NACIONAL

  • QUÉSSIA DÉBORA MAMANI FERREIRA; DEUSILENE SOUZA VIEIRA; JUAN MIGUEL VILLALOBOS SALCEDO; EDUARDO REZENDE HONDA. Expressão do antígeno delta recombinante para produção de insumos diagnósticos. XLV Congresso da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. Local: Recife - PE. Período: 08 a 12/04 de Março de 2009.
  • DEUSILENE SOUZA VIEIRA; ALCIONE OLIVEIRA SANTOS; EDUARDO REZENDE HONDA; LUIZ HILDEBRANDO PEREIRA SILVA. Amplificação, clonagem e expressão de peptídeos truncados das proteínas de envolope (e) e não estrutural (ns1) do vírus dengue. XLV Congresso da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. Local: Recife –PE. Período: 08 a. 12/04 de Março de 2009.
  • DEUSILENE SOUZA VIEIRA; ALCIONE OLIVEIRA SANTOS; JUAN VILLALOBOS SALCEDO. Identificação, quantificação e genotipagem do vírus da hepatite c em amostras de soro de pacientes da região amazônica por pcr em tempo real. XIV Congresso da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. Local: Recife –PE. Período: 08 a 12/04 de Março de 2009.

ORIENTAÇÕES EM ANDAMENTO

ORIENTAÇÃO DE MESTRADO

  • Alcione Oliveira dos Santos - Identificação e quantificação de dna do vírus da hepatite b por pcr em tempo real em amostras de pacientes da região amazônica. UNIR/IPEPATRO. Financiamento: SUS/SESAU/IPEPATRO/CEPEM.
  • Teodoro Leandro - Expressão da Corismato Sintase de Plasmodium falciparum em Sistema Eucarioto. UNIR. Financiamento: IPEPATRO/CEPEM.

ORIENTAÇÃO DE IC

  • Carina Godoy Picelli - Mapeamento de mutações do vírus da hepatite b de pacientes em acompanhamento no ambulatório de hepatites do Cepem/Rondônia. Financiamento: SUS/SESAU/IPEPATRO/CEPEM